iFlpMosaics：多光谱分析助力基因功能精准探索

大家好，今天来了解一篇《iFlpMosaics enable the multispectral barcoding and high - throughput comparative analysis of mutant and wild - type cells》发表于《Nature Methods》的研究。在现代生物医学研究中，理解基因功能是核心任务之一。其中，精准对比突变型与野生型细胞的特性和行为尤为关键。过去，常用的技术手段如 CreERT2 依赖性遗传嵌合体和 MADM 技术，在实际应用中暴露出不少问题。在此背景下，iFlpMosaics 技术应运而生，它有望成为我们探索基因奥秘的有力新工具，为基因功能研究开启新的篇章。

*本文只做阅读笔记分享*

一、研究背景

在基因功能研究中，对比携带突变基因的细胞和正常细胞是关键。然而，当前方法存在诸多问题。例如，在多数生物医学研究里，被对比的细胞常处于不同动物个体，经历不同的表观遗传变化和组织微环境，这会干扰研究结果。像在分析某些基因对细胞的影响时，由于环境差异，难以准确判断基因的真实作用。

现有用于诱导小鼠遗传嵌合体的技术，如MADM和CreERT2技术，均有明显不足。MADM技术依赖罕见的染色体间Cre依赖性重组事件，难以用tamoxifen有效诱导，需要针对不同染色体使用不同小鼠品系，应用受限，且在静止细胞中难以诱导，不适用于多基因上位性分析。CreERT2技术虽然能调控重组事件的位置、时间和频率，但Cre活性报告等位基因无法准确报告其他floxed基因的重组，产生大量假阳性和假阴性结果，并且只能诱导伪突变细胞标记，不利于比较分析。

二、iFlpMosaics技术介绍

（一）iFlpMosaic小鼠的设计与验证

为克服现有技术缺陷，研究团队开发了iFlpMosaic小鼠。通过一系列实验验证其有效性，确认了不同报告基因和floxed等位基因的Cre依赖性重组效率差异大，且在低剂量tamoxifen下，两个独立floxed等位基因的期望重组频率（真阳性）很低，这表明CreERT2依赖性嵌合遗传学在研究单细胞生物学中存在局限性。

团队开发了包含多个小鼠品系的工具盒，如R26-iFlpMTomato-Cre/MYFP和Tg-iFlpMTomato-H2B-GFP-Cre/MYFP-H2B-Cherry-FlpO。这些品系能在表达FlpO或FlpO-ERT2的组织中，对突变细胞（表达荧光膜标记的tomato蛋白和Cre）和野生型细胞（表达膜标记的YFP）进行荧光标记。

在ES细胞和小鼠中，实验表明初始诱导的细胞比例在长时间培养或胚胎发育过程中保持稳定，说明相关表达对细胞无毒性。并且，iFlpMosaic小鼠构建体中的荧光蛋白在无额外FlpO表达等位基因时无泄漏。

MTomato-2A-Cre+细胞能有效重组其他Cre报告等位基因和测试的floxed基因，保证了分析的高遗传可靠性。

（二）泛在和组织特异性FlpO-ERT2小鼠的产生

研究团队致力于增强FlpO-ERT2表达，开发了新构建体并筛选出Tg(Ins-CAG-FlpO-ERT2)转基因小鼠品系。与已发表的R26CAG-FlpO-ERT2品系相比，该品系在胚胎和不同器官中诱导iFlpMosaic等位基因重组的频率显著提高，使突变和野生型细胞能在同一组织微环境中进行比较。

同时，团队开发方法将现有CreERT2表达转基因等位基因改造为可实现FlpO-ERT2组织特异性表达，如生成的Cdh5-FlpO-ERT2小鼠品系能在内皮细胞中特异性诱导iFlpMosaics重组。

此外，通过开发iFlpH2B-CherryGPP/Cervlean等位基因提高了克隆分辨率，结合iFlpMosaics和iCreMVP/TomatoMTP等位基因可获得更多荧光条形码，进一步增强了单细胞和克隆定量分辨率。

（三）iDre/Flp等位基因实现单细胞后代遗传嵌合体诱导

iDre/Flp等位基因可被DreERT2或FlpO-ERT2诱导，研究团队生成Tg(Ins-CAG-DreERT2)等位基因，提高了重组效率。

该等位基因与iFlpMosaics结合，可在tamoxifen诱导下产生源自同一祖细胞的突变和野生型细胞的遗传嵌合体。在胰腺和视网膜中证实可产生双斑点克隆，新的Ki67-2A-DreERT2等位基因可在不同器官的增殖细胞中诱导双斑点克隆。

三、iFlpMosaics技术的应用展示

（一）比例功能遗传学分析

iFlpMosaics技术具有比例性，可通过组织学或FACS定量分析同一组织中突变和野生型细胞群体比例，这为研究基因细胞自主功能提供了新途径。例如，研究人员结合不同等位基因，分析多种基因（如Myc、Foxo1/3/4、Rbpj、Notch1/2/3）在胚胎发育、组织细胞克隆扩增和细胞竞争生存中的作用。在分析Myc基因时发现，与之前认为的Myc缺失导致内皮细胞增殖受抑制不同，通过iFlpMosaics技术发现其在胚胎发育过程中对内皮细胞克隆扩增影响较小，而对造血谱系影响较大。

在分析Foxo1/3/4基因时，发现其在肝脏和肺中的缺失对细胞扩增影响较小，但对心脏细胞影响较大，且对视网膜内皮细胞的增殖有显著影响。这些研究充分展示了iFlpMosaics技术在分析基因细胞自主功能方面的有效性。

（二）单细胞功能嵌合遗传学分析

以肝脏和胰腺为例，iFlpMosaic×iFlpH2B-Cherry/GFP/Cerulean小鼠在P1诱导，P20收集肝脏进行分析。研究发现，肝细胞克隆扩增有限，多数肝细胞在20天内仅分裂一两次，只有少量肝细胞能形成较大克隆。

而胰腺细胞的扩增能力更强，野生型胰腺细胞的平均克隆大小比肝细胞大。在成年肝脏中，正常稳态下肝细胞增殖有限，但Myc缺失导致突变细胞显著减少，提示存在细胞竞争。这些结果表明iFlpMosaics系统可有效追踪单细胞克隆动态，深入揭示基因对细胞的影响。

（三）单细胞RNA测序分析

结合iFlpMosaics和scRNA-seq对胚胎细胞进行分析，以Rbpj和Notch1/2/3基因为例。在Rbpj基因研究中，通过诱导其在胚胎中的嵌合缺失，发现该基因对多种细胞类型（如外周神经元、内皮细胞、心肌细胞等）的分化和扩增有重要影响。在Notch1/2/3基因研究中，发现其在胚胎早期对维持神经元祖细胞池、防止过早分化和耗竭起关键作用。这些研究展示了iFlpMosaics技术在确定细胞自主基因功能方面的强大作用，为深入理解基因在胚胎发育中的作用提供了重要资源。

四、研究总结

iFlpMosaics技术克服了现有技术的诸多局限，能够同时诱导和分析突变与野生型细胞，极大提高了基因功能研究的准确性。该技术在多种细胞类型中可诱导遗传嵌合体，有效提高了分析基因细胞自主功能的效率和通量。通过iDre/Flp等位基因实现从单细胞诱导遗传嵌合体，为研究基因在单细胞生物学中的作用提供了有力工具，对深入理解基因在组织发育、再生和疾病中的作用具有重要意义。

五、一起来做做题吧

1、与传统的CreERT2依赖性遗传嵌合体技术相比，iFlpMosaics技术的优势在于

A.只能在特定组织中诱导遗传嵌合体

B.对野生型细胞和突变细胞的标记不可靠

C.可同时对野生型和突变细胞进行可靠标记，且重组精确性高

D.不能与现有的floxed基因兼容

2、在iFlpMosaics技术中，用于实现重组酶依赖的比率诱导的元件是

A.CreERT2

B.FlpO/FlpO-ERT2

C.DreERT2

D.iDre/FlpProgenitor

3、iFlpMosaics技术中，以下哪种情况不是其相对于MADM技术的优势

A.可在任何静止或增殖细胞中诱导遗传嵌合体

B.具有更高的诱导性和灵活性

C.可实现更高的细胞条形码多样性

D.依赖于罕见的染色体间重组事件

4、在iFlpMosaic小鼠中，MTomato-2A-Cre+细胞的作用是

A.仅用于标记野生型细胞

B.仅用于标记突变细胞

C.可有效重组其他Cre报告基因和测试的floxed基因

D.对基因重组无作用

5、通过iFlpMosaics技术与单细胞RNA测序（scRNA-seq）结合的研究，发现了什么

A.只能分析少数几种细胞类型的基因功能

B.无法揭示基因缺失对细胞分化和转录程序的影响

C.可以确定细胞自主基因功能，如RBPJ和NOTCH信号在胚胎发育中的作用

D.对基因功能的分析结果不可靠

参考文献：

Garcia-Gonzalez, I., et al. iFlpMosaics enable the multispectral barcoding and high-throughput comparative analysis of mutant and wild-type cells. Nat Methods (2024).