【速览】CCR5拮抗剂可减少感染hu-PBL-NSG小鼠中HIV诱导的淀粉样变性、tau蛋白病变、神经退行性变以及血脑屏障改变

原文标题：CCR5 antagonist reduces HIV-induced amyloidogenesis, tau pathology, neurodegeneration, and blood-brain barrier alterations in HIV-infected hu-PBL-NSG mice

原文作者：Biju Bhargavan, Shawna M. Woollard, Jo Ellyn McMillan and Georgette D. Kanmogne.

背景

HIV感染者中存在神经认知功能障碍，常与阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease，AD）类似的脑病理有关，包括β淀粉样蛋白（Amyloid-Beta，Aβ）和Tau蛋白（后文简称Tau）磷酸化增加。本研究旨在确定HIV-1感染是否在HIV/艾滋病的人源化小鼠模型中引起AD样病理变化，以及CCR5拮抗剂马拉维若（Maraviroc，MVC）是否能改变HIV引起的病理变化。

方法

将NOD/scid-IL-2Rγc敲除小鼠植入人外周血淋巴细胞，然后感染HIV-1，不进行治疗或给予MVC（120 mg/kg，每日两次）治疗。通过流式细胞术每周对动物血液中的人类细胞进行定量。在感染后第3周处死动物；通过p24抗原酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）、RNA原位杂交技术（RNAscope）和实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR）对血液和组织中的HIV RNA载量进行定量。通过免疫组织化学、免疫荧光、免疫印迹（Western blotting，WB）和qPCR定量脑组织中人类（HLA-DR+）细胞、Aβ-42、磷酸化Tau蛋白（p-Tau）、神经元标记物【（MAP 2、NeuN、神经丝蛋白-L（Neurofilament-L, NFL）】、γ-分泌酶激活蛋白（Gamma-Secretase Activating Protein，GSAP）和血脑屏障（Blood-Brain Barrier，BBB）紧密连接（Tight Junction，TJ）蛋白的表达和转录。通过ELISA定量血浆Aβ-42、Aβ-42细胞摄取、释放和跨内皮转运。

结果

1 MVC可防止感染HIV小鼠中HIV诱导的免疫抑制

在感染前以及感染后第1、2和3测量动物血液中人类（hCD45+、hCD3+、hCD4+ 和hCD8+ ）细胞的水平。发现HIV-1感染显著降低了人类CD4+T细胞的数量和CD4/CD8比例，这表明HIV-1感染导致了免疫抑制。MVC治疗显著提高了感染动物的CD4+T细胞数量，减少了CD8+T细胞的增加，从而改善了CD4/CD8比例。（图1）

图 1 MVC能够防止HIV感染导致的免疫抑制

注：在感染前和感染后第1周、第2周、第3周时，通过流式细胞术对每个血样中人类CD4+（a、b）、CD8+（c、d）和CD45+T细胞的数量进行量化。每个样本中CD4+ 和CD8+ 细胞的数量被调整为与样本中CD45+ 细胞的数量相等；（e、f）CD4/CD8比例。

2 MVC降低了病毒血症，并消除了受感染动物大脑中HIV诱导的细胞浸润

采用超高效液相色谱-串联质谱法对接受MVC治疗（在第3周）的小鼠的血浆和脑组织中的MVC进行了定量分析。发现血浆和脑组织中的MVC水平呈正相关（皮尔逊r＝0.638），但未达到统计学意义（P ＝0.09）。对4组小鼠脑组织中HIV的RNAscope定量检测显示，感染动物的大脑中病毒拷贝数很高，而MVC治疗使大脑中的HIV RNA载量降低了11.75倍（图2a～c，P ＜0.0001）。qPCR对病毒基因的定量分析也显示，在感染动物的脑组织中，HIV-1 gag、pol、LTR和tat水平较高而MVC治疗显著降低了这些病毒基因各自的水平（图2d，P ＜0.0001）。MVC治疗使血浆病毒p24水平降低了2.5倍（图2e，P ＜0.0001）。对动物脑组织中人类（HLA-DR+ ）细胞的定量分析显示HIV感染动物的大脑中细胞浸润显著增加。与未感染的对照组（PBS组或MVC组）相比，HIV感染动物大脑中的平均HLA-DR+ 细胞数量高出2.3至2.58倍（图2f～h）。与感染且未治疗的动物相比，MVC治疗（MVC＋HIV）使感染动物大脑中的HLA-DR+ 细胞数量减少了2.13倍（图2h，P ＜0.0001）。

图 2 MVC降低了感染动物脑内的病毒血症，并消除了HIV诱导的细胞浸润

注：通过RNAscope量化了脑内HIV RNA拷贝数（黄色箭头所示），并为每个实验组提供了代表图像，包括触觉皮层（a）和硬膜/触觉皮层层1（b）；（c）使用Metamorph软件对所有样本中的HIV RNA拷贝数进行量化。对于每个动物脑样本，分析了10个随机视野（5个来自触觉皮层，5个来自硬膜/触觉皮层层1）；（d）使用qPCR量化脑组织中HIV-1 gag、pol、LTR和tat基因的水平，并对样本中的hCD45+ 细胞水平进行归一化；（e）使用ELISA量化血浆样本中HIV-1 p24抗原的水平；（f、g）使用免疫组织化学分析脑组织中的HLA-DR表达，并为每个实验组提供了代表图像，包括触觉皮层（f）和硬膜/触觉皮层层1（g）；（h）使用Metamorph对所有样本中的HLA-DR+ 细胞进行量化。

3 MVC限制了HIV诱导的血脑屏障改变

HIV-1感染降低了BBB TJ蛋白（如claudin-5、ZO-1和ZO-2）的表达，这可能导致BBB的完整性受损。MVC治疗防止了HIV-1引起的紧密连接蛋白表达下降，从而保护了BBB的完整性。（图3）

图 3 MVC消除了HIV引起的BBB改变

注：通过免疫组织化学（a、b）或免疫荧光（e、f、i、j）分析脑内皮细胞紧密连接蛋白claudin-5（a～d）、ZO-1（e～h）和ZO-2（i）的表达，并用DAPI（蓝色）进行核染色；Metamorph软件用于在所有样本中量化claudin-5（b）、ZO-1（f）和ZO-2（j）的水平；对于每个样本，从体感皮层中随机选取10个视野进行分析；还使用了免疫印迹（c～g、k）和密度测定（将样本的β-肌动蛋白水平作为参照）来量化样本中的claudin-5（c、d）、ZO-1（g、h）和ZO-2（k、l）的水平。

4 MVC限制HIV诱导的神经元标记物map2、NeuN和NFL的下调

HIV-1感染降低了神经标记物（如MAP 2、NeuN和NFL）的表达，这表明HIV-1感染可能导致神经元损伤。MVC治疗防止了HIV-1引起的神经标记物表达下降，保护了神经元的结构和功能。（图4、5）

图 4 MVC阻止了HIV诱导的神经标记物MAP 2和NeuN的下调

注：（a）脑组织中MAP 2表达的免疫组织化学分析（体感觉皮层）；（b）所有样本中MAP 2表达的Metamorph量化；通过WB（c）对脑组织中MAP 2的表达进行定量，然后通过密度测定将结果标准化到样本的β-actin水平（d）；（f）脑组织中NeuN表达的免疫组织化学分析（体感觉皮层）；（g）所有样本中NeuN的Metamorph量化；通过WB（h）对脑组织中NeuN的表达进行定量，然后通过密度测定将结果标准化到样本的β-actin水平（i）；通过实时PCR（e、j）对脑组织中MAP 2和NeuN的mRNA水平进行定量。

图 5 MVC阻止了HIV诱导的NFL的下调

注：（a）脑组织中NFL的免疫荧光分析；（b）对所有样本（体感皮层，每个样本分析10个随机视野）进行NFL表达的密度测定；（c）通过WB对动物脑组织中NFL的水平进行定量（d）；然后通过密度测定将结果归一化至样本的β-肌动蛋白水平；（e）通过实时PCR对脑组织中NFL mRNA的表达进行定量。

5 MVC限制HIV诱导的CNS GSAP和Aβ形成和积累，但增加了血浆Aβ水平

HAND与类似阿尔茨海默病的病理特征有关，为了确定MCV对这类病理特征的影响，研究接下来使用免疫组化（图7a～c）以及WB（图6d、e）对四组小鼠的脑组织进行分析。分析显示，对照组小鼠脑组织中无Aβ-42，但HIV感染动物的脑组织中Aβ-42的形成和积累增加（图6a～e）。免疫组化分析表明，与HIV组小鼠相比，MVC治疗组 Aβ-42 水平降低了4.26倍（图6a～c，P ＜0.0001）。WB也证实了这些发现。对于PBS组和MVC组的动物，免疫组化（图6a～c）和WB（图6d、e）分析显示脑组织中未检测到Aβ-42。研究还发现，HIV感染和MVC治疗组的血浆Aβ-42水平比PBS组水平分别高出1.67倍和5倍。（P ＝0.0005，图6g）。接下来，该研究对GSAP进行了分析，该蛋白是APP切割为Aβ的特异性激活剂，其表达水平与AD的易感性和严重程度相关。qPCR分析显示，与对照物组相比，HIV-1感染使脑组织中的GSAP mRNA增加了13至15倍（图6f，P ＜0.0001），而接受MVC治疗的感染动物脑组织中GSAP mRNA水平则降低了3倍（图6f，P ＝0.0008）。

图 6 中枢神经系统GSAP和Aβ检测

注：通过免疫组织化学使用Aβ1-42抗体对躯体感觉皮层（a）和下丘脑区域（b）的Aβ形成进行定量，然后使用密度测定法对所有样本中的Aβ水平进行定量（c）；每个样本（5个来自躯体感觉皮层和5个来自下丘脑区域的随机视野）分析10个随机视野（c）；还通过WB和密度测定法对脑组织中的Aβ水平进行了分析（d），并将结果与样本的β-肌动蛋白水平进行归一化（e）；免疫组织化学和WB均显示PBS或MVC组的脑组织中没有Aβ；通过实时PCR对脑组织中GSAP（催化Aβ形成的酶）的mRNA水平进行了定量（f）；通过ELISA对血浆中的Aβ1-42进行了定量（g）。

6 MVC限制HIV诱导的Tau蛋白磷酸化

HIV-1感染增加了大脑和血浆中的Aβ-42水平，以及Tau蛋白的磷酸化，这与AD样病理学特征相符。MVC治疗减少了大脑中的Aβ-42和磷酸化Tau水平，但增加了血浆中的Aβ-42水平，这可能表明MVC促进了Aβ从大脑到外周血的清除。（图7）

图 7 MCV消除了HIV诱导的Tau磷酸化增加

注：通过免疫组织化学（a、b）和随后的密度测定定量分析（c、d），以及WB（e）和随后的密度测定定量分析（f），分析了每个脑样本海马齿状回中pTau（Thr181）（a、c、e、f）和总Tau（b、d、e）蛋白质的水平；通过WB（g）和随后的密度测定定量分析（h～k），还量化了每个样本海马齿状回中pTau（Ser396）、pTau（Ser199）、pTau（Thr231）和pTau（Thr205）的水平。

讨论

本研究结果显示MVC显著减少了HIV引起的淀粉样蛋白生成、GSAP、磷酸化tau蛋白、神经退行性病变、血脑屏障改变以及脑组织中白细胞的浸润。MVC通过LRP1途径增加了细胞膜上Aβ的排出和跨内皮细胞Aβ的转运。因此，治疗性靶向CCR5可能是一种有效的策略。

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蔚家琪，女，首都医科大学附属北京佑安医院2024级科学学位博士研究生，导师张彤教授。

张彤，女，北京人，中共党员，医学博士，主任医师，教授，博士研究生导师，博士后合作导师。现任首都医科大学附属北京佑安医院感染中心主任、感染性疾病教研室主任，兼北京市性病防治所副所长、首都医科大学艾滋病临床诊疗与研究中心（佑安）执行主任。张彤教授从事感染性疾病的临床、科研、教学及管理工作30余年，是中国性病艾滋病防治协会学术委员会秘书长、中国性病艾滋病防治协会抗机会性感染分会副主任委员、中华医学会感染病学分会艾滋病学组委员、北京医学会感染病学分会常委兼艾滋病学组副组长、北京市艾滋病治疗专家组委员兼秘书。张彤教授还是北京市高层次公共卫生领军人才、北京市医院管理中心人才培养计划“登峰”人才、北京市总工会及北京市医院管理中心感染性疾病防治创新工作室领军人，享受国务院政府特殊津贴。张彤教授多次带领团队参与国家和北京市艾滋病、新冠、SARS等重大和突发传染病的现场处置和诊疗方案制定。张彤教授培养本科生、研究生及医护人员数千名，部分成长为全国各地感染性疾病防治的领导、骨干力量。张彤教授作为课题负责人多次承担国家自然科学基金、科技部传染病防治重大专项、北京市科技计划等课题。张彤教授在N Engl J Med 、Immunity 、J Infect Dis 等发表论文100余篇，参编著作10余部，多次获北京市科技进步奖、中华医学科技奖、北京医学科技奖和华夏医学奖等。

撰稿：蔚家琪

编辑：季嘉豪、周月芳

审核：张彤

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