华农再发PC！揭示林地草莓中BARE通过生长素途径调控花器官的发生

华中农业大学园艺学院康春颖教授团队前期在Plant Cell发表成果，通过EMS诱变筛选并基于全基因组重测序、转录组、植物激素和分子实验鉴定和验证了一个MYB转录因子（FveMYB117a），其可以调控草莓中细胞分裂素稳态从而抑制腋芽的生长（项目文章 | 华中农业大学团队揭示草莓腋芽中激素稳态调控的发育机制）。近日，该团队利用同样的策略于The Plant Cell期刊再发文揭示花的发育机制，题为“The AP2 transcription factor BARE RECEPTACLE regulates floral organogenesis via auxin pathways in woodland strawberry”，该研究对林地草莓突变体裸花托进行鉴定，该突变体产生的花心皮和其他花器官大大减少，结果表明，BRE编码的AP2转录因子可直接调控生长素路径多个基因的转录水平，影响生长素稳态和信号，从而调控花器官形成。迈维代谢提供了植物激素的检测分析服务。

1.通过EMS诱变在草莓中筛选出一个突变体，同源序列分析表明 BRE编码一个与拟南芥DRNL和DRN同源的AP2转录因子，可以调控花器官发育，尤其是导致心皮发育不完全；

2.RNA-Seq结果表明，在幼花组织中高表达，且生长素的生物合成、运输和信号转导相关的基因在花中差异表达，说明在突变体中生长素通路被严重破坏；

3.DAP-seq结果和分子验证实验表明BRE直接结合和的基因区域；且作用于的下游；

4.BRE结合生长素通路中的靶基因。包括和，同时突变体的生长素通路受到严重干扰。

1.林地草莓心皮发育不完全的突变体中花器官较少

为了分离可调控花发育的重要基因，作者对林地草莓的M代EMS诱变群体进行了筛选。一个突变体在所有花器官中，特别是心皮中的数量大大减少，被命名为裸花托(图1 A-C)。其中，野生型(WT)萼片和苞片的平均数量为10.2，裸花托为2.5，花瓣的平均数量为5.2，裸花托为0.2，雄蕊的平均数量为20，裸花托为2.6，心皮的平均数量为159.5，裸花托为5.5。花瓣的尖端有较深的锯齿(图1D)。除去萼片或苞片后，可见少量异常的心皮和雄蕊(图1E)。特别是每个野生型心皮都有一个长花柱，一个绿壁子房，里面有一个白色的胚珠，相比之下，只有白色裸露的胚珠样器官，由于缺少花柱，导致雌性不育(图1F)。在WT中每个心皮在受精后变成瘦果，里面有一颗种子，而花托变成多汁的果肉，但在中大多数花托没有扩大，缺乏受精瘦果。偶见增大的花托，但无瘦果(图1G)。

利用扫描电子显微镜对早期发育阶段的解剖花蕾进行了观察，比较了野生和两种植物的花蕾发育情况。在WT中5个萼片首先从花分生组织的外围萌发，花瓣原基在苞片内部萌发，然后雄蕊原基迅速萌发，最后心皮原基从花托向上萌发。与此相反，在中花器官发育严重受阻，萼片和苞片原基被破坏，使得其后期形成的心皮原基很少，雄蕊也出现畸形(图1H)。这些结果表明，是草莓花器官发生所必需的。

图1 林地草莓中突变体的表型特征

2.编码一个与拟南芥DRNL和DRN同源的AP2转录因子

将突变体回交到WT，F后代均为WT，表明这是一种隐性突变。为了分离致病基因，对回交F群体中的WT和突变株进行了大量分离，并进行了基因组重测序。数据分析显示一个错义突变与突变表型密切相关。该突变发生在FvH4_4g25630的编码区，导致残基81的氨基酸从Gly变为Arg，该氨基酸在N端AP2结构域高度保守(图2 A和B)。为了证实这一结果，作者在该位点分别对50个F突变体进行了Sanger测序，发现了第二个EMS突变体，它表现出与bre相同的叶和花表型。在中，在FvH4_4g25630中发现了一个导致过早终止密码子的突变(图2 A和B)。因此，FvH4_4g25630可能是。根据系统发育树，BRE/FvH4_4g25630编码拟南芥DRN和DRNL的草莓同源物，与DRNL的相似性高于与DRN的相似性(图2C)。烟叶中的瞬时表达实验显示，融合的BRE-GFP蛋白定位于细胞核，与其作为转录因子的作用一致(图2D)。

为了进一步验证基因的同源性，作者构建了可稳定转化为突变体，与相比，在T大体上恢复了花的形态(图2E)，转基因品系的花器官数量与bre相比显著增加，与WT相当(图2F)。根据RT-qPCR结果(图2G)， 在中的表达水平明显高于WT，表明BRE本身具有反馈调节作用，而Comp系中的表达水平甚至高于，这可能是由于转基因的插入位点或构建体中缺乏某些调节序列引起的。总之这些结果表明编码AP2转录因子。

图2 编码一个AP2转录因子

3.在幼花器官中高表达

林地草莓(Li et al., 2019a)的转录组数据显示，在REM(6-7阶段的花托)、SFM(1-4阶段的花分生组织)、6-7阶段幼心皮和第3阶段胚胎中高表达，但在果实组织(皮层、髓和细胞壁)中表达较低或不表达(图3A)。为了证实其表达模式，共获得10个转基因林地草莓株系，通过GUS染色检测其表达模式，根据GUS信号，在幼嫩花蕾中广泛表达，包括幼嫩雄蕊和心皮，并且在花柱第9阶段优先表达(图3B)。由于转基因可能异位表达，因此作者对WT花蕾进行了RNA原位杂交，同样，转录本在花的分生组织、幼心皮和雄蕊、柱头、胚珠、叶原基和幼叶片中都被检测到(图3C)。这些结果表明，可能在花器官的发生和发育中起着至关重要的作用。

图3 野生型林地草莓中的表达模式

4.通过RNA-seq和DAP-seq鉴定调控的基因

为了鉴定受调控的基因，作者对和WT在1-7阶段的幼芽进行了转录组分析，并进行了3次生物重复。转录组的差异分析结果显示，与WT相比，花中共有1449个基因显著上调，而只有387个基因下调(fold change > 2, p-adj 这表明在突变体中生长素通路被严重破坏。

为了在全基因组范围内识别BRE结合位点，该研究进行了DAP-seq。从整个基因组的10801个富集的BRE-IP峰中共鉴定出9427个基因，这些峰的基因组分布显示，34.58%位于第一个外显子，13.42%位于其他外显子，16.3%位于启动子区域(转录起始位点-2 kb)，9.27%位于5 ' -UTR，少部分位于内含子和3 ' - UTR(图4D)。富集的BRE结合基序主要包含GCC-box核心序列GCCGCC(图4E)，这是AP2/ERF转录因子识别的典型基序。在花中的DEGs中，119个下调基因和518个上调基因含有潜在的BRE结合位点(图4F)，这些都是候选的下游基因。

图4 通过RNA-seq和DAP-seq鉴定调控的基因

5.BRE直接结合和的基因区域

DAP-seq数据显示，两个BRE- IP峰位于的启动子和第2外显子，一个BRE-IP峰位于的第1外显子，提示这两个基因可能是BRE的直接靶点(图5A)。为了验证这一假设，作者进行了酵母单杂交(Y1H)试验。BRE在和的三个靶区检测到正相互作用信号(图5B)。在电泳迁移迁移试验(EMSA)中，当纯化的重组BRE与或中的靶序列混合时，DNA-蛋白复合物显示出迁移迟缓(图5C)，通过添加越来越多的未标记的竞争物来减弱复合物的形成，对于启动子，加入突变的BRE蛋白或者未观察到结合。对于和外显子，突变的靶序列在×25浓度下不能与野生型靶序列竞争，因此没有降低BRE与野生型靶序列的结合亲和力。双荧光素酶报告试验用于研究BRE对目标序列转录活性的影响，与空载体对照相比，与含和启动子或外显子的LUC报告子共转化显著提高了LUC/REN比率，而突变的BRE蛋白则没有这种现象(图5D)，表明BRE是和表达的正调节因子。此外，作者通过稳定转化获得了转基因林地草莓株系，并进行了染色质免疫沉淀(ChIP)-qPCR检测，以验证BRE在体内与这些基序的结合。结果显示，免疫沉淀后和的GCC-box基序中BRE显著富集(图5E)。作者还观察到和在突变体中显著降低，而在对照品系中显著升高(图5F)。以上结果表明，和可能是草莓中BRE的直接靶点。

图5 BRE直接结合到和的基因区域

6.在花的器官发生过程中作用于BRE的下游

林地草莓中的突变体的花器官数量发生了改变(Lu et al., 2023)。为了更好地了解在花器官起始中的作用，作者用扫描电镜观察了强突变体(简称)的幼芽。在第6阶段，由于萼片和苞片较少，雄蕊和花托暴露在外(图6A)。在一些花中，花托顶端在后期没有形成心皮(图6A)。这些结果表明，突变体具有与bre相似的花器官起始缺陷，不过程度较轻。为了更好地了解BRE和之间的关系，作者还比较了它们的表达模式。基于林地草莓转录组数据(Kang et al.，2013;Hollender et al.，2014;Li et al.，2019b)， 和在SFM、REM、7-10阶段幼心皮、胚胎3-4阶段和幼叶中共表达(图6B)。先前的转录组分析显示，与WT相比，幼芽在1-7阶段有278个基因下调，559个基因上调(fold change > 2, p这些数据表明，和在花发育过程中调控一个常见的基因集。

为了检验与之间的遗传互作，作者构建了双突变体(图6E)。的雄蕊数低于，表明与之间存在协同作用。然而的萼片/苞片、花瓣或心皮的数量与没有显著差异(图6F)，这表明这两个基因在一个共同的途径上起作用。突变体的缺陷明显比突变体轻(图6E和6F)，说明除了调控外，还可能调控其他基因。

图6 在花器官起始过程中作用于的下游

7.突变体的生长素通路受到严重干扰

由于YUC家族基因和受BRE的转录调控，作者假设内源性IAA水平可能在BRE中发生改变。为了验证这一假设，作者用WT和的第1-7阶段花蕾来量化生长素的含量。结果表明和WT之间的游离生长素没有显著差异，但是IAA合成的前体色氨酸(Trp)和IAA-氨基酸偶联物IAA- Ala在突变体中显著增加，而OxIAA和IAA- Asp在突变体中显著减少(图7A)，这些结果表明BRE破坏了生长素的稳态。

为了进一步观察中的生长素信号转导途径，将先前描述的林地草莓报告系杂交到中(Feng et al.，2019)。GUS染色显示，在WT染色7 h后，在第2-7阶段蓝色信号分布在花蕾中，在第9阶段仅在柱头中检测到信号，而在中蓝色信号则弱得多，主要位于维管束中(图7B)，表明中生长素信号转导减少。此外，对突变体进行培养，并用不同浓度的吲哚-3-丁酸(IBA)处理，但这种处理没有挽救花器官的缺陷表型(图7C)。

此前课题组获得了由于过表达而表现出高生长素表型的转基因植株(Lu et al.，2023)。通过杂交将该结构引入到中以增加内源性IAA水平(图7D)。RT-qPCR结果显示，在中的表达水平较bre中明显升高(图7E)。引入后，叶片叶柄也随之变长(图7F)。然而，中的花器官缺陷保持不变(图7G)，这可能是由于与生长素途径之间复杂的相互作用。为了测试BRE与生长素途径之间的相互作用，将生长素运输抑制剂萘草胺(NPA)应用于WT和突变体，结果表明NPA处理导致花器官减少，心皮异常，无花柱或仅由裸胚珠组成(图7 H和I)，更重要的是，对NPA处理非常敏感，即使在低浓度下也能产生针状花序/花，没有花器官(图7H)。这些结果表明，生长素通路在中受到严重破坏。

图7 与生长素途径相互作用

8.BRE直接调控其他几个生长素途径基因的表达

作者利用RNA-seq和DAP-seq寻找生长素通路中BRE的其他靶基因。最终选择了5个具有差异表达和富集结合峰的候选候选物，包括和(图8A)。RT-qPCR结果显示，与WT相比，突变体中和的表达显著降低，而系中和的表达显著上调，系中和的表达显著下调(图8B)。EMSA显示，BRE直接结合到含有这些基因的GCC-box上，而突变的GCC-box则没有这种相互作用(图8C)。然后用转基因林地草莓株系对这些基因进行ChIP-qPCR，结果表明GFP抗体免疫沉淀后，DAP-seq中所有5个基因的峰值区域都比输入区显著富集，而对照区没有富集(图8D)。这些结果表明，BRE直接调控林地草莓花发育过程中参与生长素结合、运输和信号转导的几个生长素通路基因的表达。

图8 BRE直接结合到5个生长素途径基因的基因区域

草莓花的一个显著特征是在花托上有许多独立发育的心皮。该研究构建了林地草莓突变体，这些突变体的花器官基本没有或很少，特别是心皮。分子验证结果表明，BRE可以直接调节生长素通路中几种基因的表达，包括生物合成、偶联、转运和信号传导。说明BRE通过调控不同阶段的生长素通路促进草莓花器官的形成。这为了解DRN/DRNL同源基因的保守性和多样性功能以及草莓花器官形成的机制基础提供了进一步的见解(图9)。

图9 BRE在草莓花发育中的作用模型